PCR-Optimierung < Biologie < Naturwiss. < Vorhilfe
|
| Status: |
(Frage) beantwortet  | | Datum: | 09:33 Mi 09.10.2013 | | Autor: | Chrischi |
Hey Leute,
Ich habe eine PCR gemacht und die Bande, die ich auf dem Gel erhalten habe daraufhin extrahiert, um dann eine weitere PCR zu machen. Bei der 2. PCR sollten eigentlich Produkte verschiedener Längen entstehen, sodass natürlich mehrere Banden sichtbar werden, (genauer sind die Amplikongrößen: 763/1776/2710/3682). Als Ergebnis habe ich jedoch NUR die 763-Bande bekommen. Habe es schon versucht indem ich die Primerkonzentration und die Magnesiumchloridkonzentration erhöhte, jedoch ohne Erfolg, es taucht immer nur die 763-Bande auf.
Hat jemand eine Idee? Ich würde mich über jeglichen Rat sehr freuen.
Ich habe diese Frage in keinem Forum auf anderen Internetseiten gestellt.
|
|
| |
|
| Status: |
(Antwort) fertig  | | Datum: | 16:12 Mi 16.10.2013 | | Autor: | giskard |
Hallo Chrischi,
Verstehe ich dich richtig, dass die 2. PCR eine Multiplex-PCR ist? Wenn Du nur das kleinste Produkt bekommst, lohnt es sich evtl, die Elongationszeit zu verlängern. Dabei gilt im allgemeinen mindestens 30 sek / 1000 bp, zur Sicherheit rechne ich aber meist mit 50-60 Sek/ 1000 bp.
Ansonsten hilft manchmal auch die Zugabe von DMSO, das erhöht die Spezifität der Primer, verringert aber auch die Effizienz der PCR.
Ich, das hilft Dir ein wenig.
Viele Grüße,
Karsten
|
|
|
|
